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LA APORTACIÓN DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO AL DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DEL ORIGEN HUMANO O ANIMAL DE CENIZAS, PROCEDENTES DE UNA INCINERACIÓN REALIZADA FUERA DE ESPAÑA.
ESTUDIO DE UN CASO LEGAL.
PROF.GARFIA.A
121.-
SCANNING ELECTRON MICROSCOPY (SEM) CONTRIBUTION TO THE DIFFERENTIAL DIAGNOSIS BETWEEN HUMAN ASHES FROM ANIMAL ASHES IN A CASE OF COMMERCIAL CREMATION.
REPORT OF A LEGAL CASE.
PROF.GARFIA.A
Introduction
The body recovered from a fire generating considerable smoke and not too much heat may be fairly well preserved and the death a result of inhaling hot and nocives gases. The other extreme is a body so completely destroyed that it cannot be recognized as human. The forensic pathologist presented with a body recovered from a fire is handed several problems. It is said:
1.-Identification.
2.-Cause of death.
3.-Manner of death (i.e., homicide, suicide, accident).
After a fire a question frequently arises: "are the remains human?".
A variety of events can lead to burned skeletal remains.These include aircraft accidents, bombing and explosions. Homicides, suicides and accidental deaths all can involve the use of fire with variable results on human remains. Fire can be employed to attempt to destroy forensic evidence in criminal cases, often to attempt to prevent identification and recovery.
Even commercial cremations present problems for the forensic examiner. In 2006 Nelson and Winston reported that in Tucson and Pima County Arizona between 2002 and 2003, 0.8% of cremation requests resulted in being medical examiner cases after review. In addition, disputes over commercial cremations result in civil litigation that can involve forensic analysis of the recovered materials.
(D.H.Ubelaker.The forensic evaluation of burned skeletal remains: A synthesis.
Forensic Sci. Int. (2008), doi:10.1016/j.forsciint.2008.09.019).
Identifying isolated or fragmentary bones can be difficult in criminal cases. Numerous non-osseous materials can sometimes be mistaken for fragmented human bone. Human remains can often become mixed with those of animals. Identification can be further complicated by modifying factors as burning, cremation or warping. There are three levels of identification that can be utilized to distinguish between human and animal bones: gross skeletal anatomy, bone macrostruture, and bone microstruture (histology).
I have studied the histomorphometric characteristic, including Haversian canal diameter and lacunas diameter, using Scanning Electron Microscopy, in order to differentiating human ashes from animal ashes in a legal case (commercial cremation).
Fig.1-Este esquema nos muestra la estructura general de los huesos largos y el aspecto macroscópico de los dos tipos de hueso que se encuentran en el esqueleto maduro:
1.-Hueso compacto.
2.-Hueso esponjoso.
El hueso compacto forma las paredes externas, densas, del tallo o la diáfisis ósea.
El hueso esponjoso está formado por una red tridimensional de láminas o cordones óseos delgados, denominados trabéculas óseas, que dejan entre sí espacios intertrabeculares. Entre esos espacios se localizan las células responsables de la producción de los elementos formes de la sangre -leucocitos, hematíes y plaquetas. Prof. Garfia.A
I have studied the histomorphometric characteristic, including Haversian canal diameter and lacunas diameter, using Scanning Electron Microscopy, in order to differentiating human ashes from animal ashes in a legal case (commercial cremation).
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| Histopatología Forense Práctica blog 121. Foto 1 Prof. Garfia.A |
Fig.1-Este esquema nos muestra la estructura general de los huesos largos y el aspecto macroscópico de los dos tipos de hueso que se encuentran en el esqueleto maduro:
1.-Hueso compacto.
2.-Hueso esponjoso.
El hueso compacto forma las paredes externas, densas, del tallo o la diáfisis ósea.
El hueso esponjoso está formado por una red tridimensional de láminas o cordones óseos delgados, denominados trabéculas óseas, que dejan entre sí espacios intertrabeculares. Entre esos espacios se localizan las células responsables de la producción de los elementos formes de la sangre -leucocitos, hematíes y plaquetas. Prof. Garfia.A
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Fig.2.-Tipos macroscópicos de hueso: hueso compacto y hueso esponjoso. Corte sagital del fémur que incluye la cabeza femoral.
La fotografía muestra el aspecto y la distribución de los dos tipos de hueso que se pueden encontrar -macroscópicamente- en un hueso largo del esqueleto. Prof. Garfia.A
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Fig.3.-El estudio microscópico del hueso: estructura histológica del hueso compacto. Esquema.
Cuando se examina al microscopio un hueso, macroscópicamente de tipo compacto, se pone de manifiesto que este tejido posee un complicadísima estructura microscópica (se dice que la estructura y la composición del hueso compacto sirvieron como modelo a los contructores para la fabricación del cemento armado).
El hueso compacto está formado, básicamente, por "cilindros paralelos de tejido óseo" denominados "laminillas óseas" dispuestas alrededor de conductos -mal denominados canales, en inglés, ya que son estructuras cilíndricas similares a tubos- que se denominan conductos de Havers o conductos haversianos. Las laminillas que se disponen alrededor de un conducto de Havers forman las unidades estructurales del hueso compacto y se llaman sistemas de Havers u osteonas. Las laminillas óseas son, en esencia, el componente estructural fundamental del tejido óseo. Las laminillas están formadas por fibras de colágeno -dispuestas concéntricamente alrededor de los conductos- sobre las cuales se engastan los cristales de calcio en forma de hidroxiapatita. Las fibras de colágeno se mantienen embebidas en una matriz de sustancia fundamental glicoproteica (glicoproteínas sulfatadas). En los cortes transversales, los sistemas de Havers u osteonas destacan como anillos concéntricos localizados alrededor de agujeros cilíndricos (conductos de Havers). Prof. Garfia.A
Cuando se examina al microscopio un hueso, macroscópicamente de tipo compacto, se pone de manifiesto que este tejido posee un complicadísima estructura microscópica (se dice que la estructura y la composición del hueso compacto sirvieron como modelo a los contructores para la fabricación del cemento armado).
El hueso compacto está formado, básicamente, por "cilindros paralelos de tejido óseo" denominados "laminillas óseas" dispuestas alrededor de conductos -mal denominados canales, en inglés, ya que son estructuras cilíndricas similares a tubos- que se denominan conductos de Havers o conductos haversianos. Las laminillas que se disponen alrededor de un conducto de Havers forman las unidades estructurales del hueso compacto y se llaman sistemas de Havers u osteonas. Las laminillas óseas son, en esencia, el componente estructural fundamental del tejido óseo. Las laminillas están formadas por fibras de colágeno -dispuestas concéntricamente alrededor de los conductos- sobre las cuales se engastan los cristales de calcio en forma de hidroxiapatita. Las fibras de colágeno se mantienen embebidas en una matriz de sustancia fundamental glicoproteica (glicoproteínas sulfatadas). En los cortes transversales, los sistemas de Havers u osteonas destacan como anillos concéntricos localizados alrededor de agujeros cilíndricos (conductos de Havers). Prof. Garfia.A
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Los conductos de Havers, junto con sus láminas concéntricas, forman los llamados sistemas haversianos u osteonas; por dichos conductos caminan los vasos y los nervios del tejido óseo (canales neurovasculares). Los paquetes neurovasculares se conectan entre sí, y también con el endostio (la capa que reviste el hueso internamente) y el periostio o cubierta externa del hueso, a través de un sistema de conductos (conductos de Volkmann), que se encuentran interconectados con los conductos de Havers.
Cada sistema haversiano se empieza a formar a partir de un conducto amplio, en cuyas zonas periféricas las células formadoras de hueso (osteoblastos) van secretando protofibrillas de colágeno que terminan por formar fibras adultas las cuales, orientándose en el espacio, van formando las laminillas óseas. A medida que aumenta el número de laminillas depositadas, los diámetros de los conductos de Havers se reducen, y las grandes células formadoras de hueso (osteoblastos) se van quedando atrapadas (osteocitos) en pequeños huecos -localizados entre las laminillas- denominados lagunas óseas (ataúdes de los osteocitos). De esta forma, los osteocitos -células del hueso adulto que ya no poseen la capacidad secretora de colágeno- se van quedando dispuestos en anillos concéntricos entre las laminillas de colágeno. Los osteocitos reciben nutrientes a través de canalículos que contienen las prolongaciones de sus citoplasmas; los canalículos de un osteocito se comunican entre sí y con los conductos de Havers que conducen los vasos. Prof. Garfia.A
Descripción del Caso
Antecedentes
La historia de este caso se inicia tras la muerte de un ciudadano español, en un país americano, en extrañas circunstancias. La familia, residente en una importante ciudad del norte de España, fue puesta en antecedentes por vía diplomática. Asímismo, se les comunica a los familiares que el traslado del cuerpo no sería posible sino solamente las cenizas procedentes de su incineración.
La familia recibió un frasco de cristal, de los utilizados para envasar penicilina, con una cantidad de cenizas que no alcazaban sino a llenar la mitad del frasquito. Ante la sorpresa, los parientes del fallecido decidieron contratar a un abogado para litigar sobre el asunto en el país de origen. Al mismo tiempo, se incubó en ellos la sospecha de que las cenizas enviadas no pertenecían a su allegado sino que debían pertenecer a un pequeño animal. Me plantearon entonces si sería posible la identificación, humana o animal de los restos óseos enviados.
Estudio con Microscopio Electrónico de Barrido
Material recibido.-
Frasco de penicilina conteniendo numerosos fragmentos de material sólido particulado.
Examen mediante lupa.-
Puso de manifiesto que el contenido del frasquito estaba constituido por fragmentos de un material blanquecino, que presentaban un tamaño variable entre 0.3 y 1.5-2 mm, de longitud. El estudio detallado de los fragmentos, a este aumento, demostraba que la mayoría de ellos pertenecían al hueso de tipo compacto.
Algunos de los fragmentos mayores se procesaron, según la técnica convencional, para estudio con MEB. Las muestras fueron sombreadas con oro y examinadas con un microscopio Cambridge.
RESULTADOS
1.-Diagnóstico histológico.
El examen con MEB demostró que los fragmentos examinados pertenecían a tejido óseo compacto, de tipo laminar (adulto), en los que se apreciaban los siguientes elementos:
A.-Sistemas de Havers (osteonas).
B.-Lagunas óseas.
C.-Probables cristales de hidroxiapatita.
2.-Mediciones realizadas
Las medidas realizadas fueron las siguientes:
2.1 Diámetro de los conductos de Havers.
2.2 Diámetro mayor de las lagunas óseas.
Las medidas de ambos parámetros se llevaron a cabo sobre las fotografías números 5-6-7 y 8 y utilizando el marcador de micras que aparece en uno de los ángulos de las fotografías.
Diámetro de los conductos de Havers (fotografias 6 y 7).
Número de conductos medidos: 25.
Diámetros en micras:
25-25-37-25-37-25-25-25-37-37-37-37-25-62-62-50-25-25-37-37-25-37-37-75-50.
Diámetro medio:36.76 micras.
Diámetro mayor de las lagunas óseas ( fotografía nº 8).
Número de lagunas contadas: 35
Diámetros mayores: 5-7-6-12-7-6-5-7-4-4-4-5-4-6-5-6-6-7-6-4-7-6-6-6-7-7-10-7-7-6-7-6-6-10-7.
Diámetro lacunar medio:6.3 micras.
Discusion
Los métodos histológicos para la determinación del origen animal o humano de fragmentos óseos se basan, fundamentalmente, en las medidas de los diámetros de los conductos de Havers, de las osteonas o sistemas de Havers y de la densidad de osteonas en el hueso compacto. Para los autores clásicos (Simonin.- Tratado de Medicina Legal) y Janssen (Forensic Histopathology), el diámetro de los conductos de Havers es inferior a 20 micras en numerosos animales, salvo en los primates que se eleva a 32-34 micras. En los humanos suele variar, según la edad, entre 30 y 150 micras y, en cualquier caso siempre es superior a 25 (Simonin). Para Janssen, un diámetro de más de 40 micras es raro en el hueso humano. Más recientemente, Hillier and Bell (2007), han considerado que la diferencia entre humanos y determinados animales es muy difícil, o imposible, cuando solamente se obtienen muestras de hueso compacto.
Conclusiones
1.-Las muestras examinadas con el Microscopio Electrónico de Barrido pertenecen a fragmentos de hueso compacto.
2.-La estructura microscópica de los fragmentos estudiados demuestra que pertenecen al tipo laminar y que se encuentran constituidos por Sistemas de Havers u Osteonas.
3.-El diámetro medio de los conductos de Havers, que se encuentran en el fragmento óseo estudiado, es de 36,7 micras.
4.-Dicho diámetro medio es mayor que el que se encuentra en los animales.
4.-Desde el punto de vista microscópico, las muestras examinadas presentan características histomorfométricas compatibles con las descritas en restos óseos humanos.
5.-La aplicación de la Microscopía electónica de Barrido se constituye en un magnífico y rápido procedimiento -que acorta notablemente el tiempo de la técnica histológica clásica, evitando los siempre engorrosos procedimientos de la decalcificación y la microtomía de muestras muy pequeñas como las que se obtienen después de una incineración.
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| Histopatología Forense Práctica blog 121. Foto 5 Prof. Garfia.A |
Fig.5.- Cenizas óseas procedentes de una incineración. Scanning Eletron Microscopy. Microscopía Electrónica de Barrido. Fragmento de hueso compacto. Compact Bone. 90x.
A este aumento solo era posible distinguir que se trataba de hueso compacto y la presencia de numerosos agujeros, de difentes diámetros.
Prof. Garfia.A
A este aumento solo era posible distinguir que se trataba de hueso compacto y la presencia de numerosos agujeros, de difentes diámetros.
Prof. Garfia.A
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| Histopatología Forense Práctica blog 121. Foto 6 Prof. Garfia.A |
Fig.6.-Scanning Electron Microscopy. Compact Bone. Ashes from a commercial cremation. Two Havers System.
Conductos de Havers y las lagunas óseas de los osteocitos satélites componentes de dos sistemas de Havers (osteonas).240x.
Conductos de Havers y las lagunas óseas de los osteocitos satélites componentes de dos sistemas de Havers (osteonas).240x.
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| Histopatología Forense Práctica blog 121. Foto 7 Prof. Garfia.A |
Scanning Electron Microscopy(SEM).
Microscopía Electrónica de Barrido (MEB). Detalle de un conducto haversiano y de las lagunas óseas localizadas circunferencialmente alrededor de aquél (osteona incompleta).
1000x. Prof. Garfia.A
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| Histopatología Forense Práctica blog 121. Foto 8 Prof. Garfia.A |
Fig. 8.-Microscopía Electrónica de Barrido (SEM). Detalle de las lagunas óseas de la fotografía anterior.
Nótese que las laminillas óseas, que deberían encontrarse entre las lagunas óseas han desaparecido durante la incineración.
1000x. Prof.Garfia.A
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| Histopatología Forense Práctica blog 121. Foto 9 Prof. Garfia.A |
Fig. 9.-Cenizas óseas procedentes de una incineración. SEM.
La fotografía, realizada a 8.000 aumentos, muestra una laguna ósea rodeada por formaciones poligonales, muy uniformes, localizadas en los lugares donde deberían encontrarse las laminillas óseas (fibras de colágeno + cristales de hidroxiapatita). Comoquiera que la materia orgánica desaparece durante la incineración, por efecto de las altas temperaturas, suponemos que las formaciones poligonales deberían corresponder a cristales de calcio en forma de hidroxiapatita. Microscopía Electrónica de Barrido. 8.000x.
Prof. Garfia.A
Bibliografía.-
1.-Mestres P, Rasher K, Garfia.A.-
Bedeutung und perspektiven des REM
in Neuroanatomie und Experimenteller Neuropathologie.
Beitrag. Elektronenmikroskop. Direktaabb Oberfl. 13:265-276 (1980).
2.-Mestres, P, Garfia.A
Effects of Cytochalasin B on the ependyma.
In Scanning Electron Microscopy. An International Journal of SEM, related techniques and applications. Ed. B. Johari. O, and Becker R. O'hare. Chicago.USA. pp. 465-473. (1980/III).
3.-Garfia.A, Mestres. P and Rasher. K
Trinitrophenol lesions of the ventricular wall: A SEM-TEM study.
In Scanning Electron Microscopy. An International Journal of SEM, related techniques and applications. Ed. B. Johari. O and Becker R. O'hare. Chicago.USA. pp.449-456 (1980/III).
4.-Hillier, M.L. and Bell, L.S.-
Differentiating Human Bone from Animal Bone: A Review of Histological Methods. Journal of Forensic Sciences, Vol. 52, Issue 2, pages 249-263. March 2007.
5.-Janssen.W.-
Forensic Histopathology.Springer-Verlag. Heidelberg.1984.
6.-Simonin.C.-
Medicina Legal Judicial. 20 ed. 1966. Ed. Jims. Barcelona.
7.-Annamaria Crescimanno and Sam D. Stout.-
Differentiating Fragmented Human and Nonhuman Long Bone Using Osteon Circularity. Journal of Forensic Sciences. Vol 57, Issue 2, pp. 287-294. March 2012.
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6.-Simonin.C.-
Medicina Legal Judicial. 20 ed. 1966. Ed. Jims. Barcelona.
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Differentiating Fragmented Human and Nonhuman Long Bone Using Osteon Circularity. Journal of Forensic Sciences. Vol 57, Issue 2, pp. 287-294. March 2012.
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