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CURSO DE HISTOLOGÍA. TEMA 2. LOS MÉTODOS DE ESTUDIO EN HISTOLOGÍA Y CITOLOGÍA.

LOS MÉTODOS DE ESTUDIO EN HISTOLOGÍA Y EMBRIOLOGÍA.
Programa
Introducción. Técnicas vitales. Técnicas "in vitro". Técnicas postvitales.
La importancia de la correlación estructura-función. Métodos para el estudio de la estructura: Métodos de Observación (directa, microscopios ópticos y electrónicos, cristalografía y Rayos X).
Los métodos para el estudio de la función: Métodos químicos. Citoquímica e Histoquímica. Métodos físico-químicos.Fraccionamiento celular- Métodos físicos, químicos y biológicos. Inmunohistoquímica y Autoradiografía.
La obtención de muestras biológicas. Elección del método de obtención. Biopsia y necropsia. Instrumental y técnicas. Microcirugía y Microdisección. Micromanipuladores. Biopsias endoscópicas o laparoscópicas. Agujas de biopsia.
Las técnicas de observación. Observación "in vivo" (fondo de ojo, membranas epiteliales, espermatozoides). Limitaciones. La carencia de contraste.Los métodos para incrementar el contraste. Métodos físicos (microscopio de contraste de fases, de interferencia de Nomarski, de campo oscuro).Métodos químicos: la utilización de colorantes. Colorantes intravitales. La técnica de la gota pendiente. La observación "in vitro". El cultivo de tejidos y de órganos. El aumento de contraste: los microscopios especiales y las coloraciones supravitales. Las técnicas postvitales: finalidad. La autólisis cadavérica. La fijación. Dureza. Congelación. Criofractura. Cortes por congelación. La inclusión en Microscopía Optica y Electrónica. La obtención de cortes histológicos: microtomos y ultramicrotomos. Las técnicas de coloración en Microscopía Óptica y "Electrónica". La técnica de coloración con hematoxilina-eosina. Basofilia y acidofilia. La Histoquímica. La "coloración" y el montaje de las preparaciones en Microscopía Electrónica de Transmisión. La Microscopía Electrónica de Barrido. Otras técnicas. La ultracentrifugación diferencial y la centrifugación contragradiente de densidad y el fraccionamiento celular. Los mètodos Imunohistoquímicos. La Autorradiografía.


INTRODUCCIÓN

   El estudio  de las células, de los tejidos, y de los órganos podemos abordarlo desde dos diferentes puntos de vista o dos necesidades: 1) el estudio de la estructura pura y dura y 2) el estudio de la función o funciones celulares. En realidad, la separación entre ambos aspectos es, completamente, ficticia y la hago, solamente, con fines didácticos. La estructura y la función están íntimamente relacionadas. Es más, a lo largo del programa veremos, muchas veces, que la estructura está fuertemente condicionada y dirigida por la función de la célula -una neurona difícilmente podría tener una morfología mejor que la que tiene para realizar las funciones que tiene que expresar/desarrollar. 
     Los métodos para el estudio del material biológico pueden agruparse en tres grandes categorías:
    1.- Los que estudian a los organismos vivos en su estado natural; estos son los denominados MÉTODOS "in vivo". Cuando aplicamos uno de estos métodos al estudio de los seres vivos, hablamos de MÉTODOS O TÉCNICAS VITALES.
   2.- Aquellos otros métodos que lo estudian vivo pero colocado en condiciones artificiales. Estos se denominan MÉTODOS O TÉCNICAS "In vitro". 
      El nombre que se utiliza depende de que para realizar estos estudios se utilizan los cultivos de tejidos o de órganos, y la técnica se lleva cabo en placas de vidrio o recipientes especiales de vidrio, originariamente. Ahora, la mayor parte de estos dispositivos suelen ser de plástico (tubos de cultivo, placas de Petri, etc).
     3.- Existen, finalmente, otros métodos de estudio del material biológico que lo hacen después de su muerte. Estos métodos o técnicas de estudio se denominan "TÉCNICAS POSTMORTALES O POSTVITALES".
       Resulta obvio que si  lo que nos interesa es conocer, además de la estructura, el estado funcional de las células, de los tejidos, y de los órganos, lo ideal sería contar con métodos que permitieran efectuar -siempre- estudios "in vivo".
  Sin embargo, las metodologías empleadas tanto en la investigación científica como en el diagnóstico cito-histológico, modifican el estado natural del material biológico. En general, debemos enunciar aquí que para que una conclusión sea válida debería ser corroborada por varios métodos.
     En esta lección consideraremos tanto los métodos que utilizamos para el diagnóstico y el estudio de las estructuras como aquellos otros que se ocupan del análisis de las funciones biológicas.
    Las estructuras se estudian mediante los denominados: 
   
1.-Métodos de Observación. 
       La observación puede ser:
    1.1.- Directa
 La observación de la estructura se puede realizar directamente, sin interposición de ningún objeto entre el ojo humano y el objeto observado; es decir, con el ojo desnudo. Debido a esto se aplicó el término Auto-opsia = ver con mis propios ojos, al examen cadavérico, al objeto de descubrir la causa o las causas de la muerte. Este es un método de observación directa.
   1.2.- A través de Microscopios de Ópticos y Electrónicos.
   1.3.- Por medio de la Cristalografía y de los Rayos X.
      Los métodos de observación, sobre todo los microscopios, son muy útiles para interpretar el mecanismo de algunos fenómenos biológicos ya que la observación detallada de las estructuras y una secuenciación de las imágenes fotográficas -correspondientes a un mismo proceso- sobrepasan la simple información morfológica y posibilitan, notablemente, una correlación entre estructura y función.
  
Los límites de la capacidad de resolución.

La capacidad de resolución es la capacidad  de discriminar dos puntos como diferentes. El llamado límite de resolución, se define como la distancia que debe existir entre dos puntos para que puedan ser discriminados o visualizados como diferentes. 
      En el esquema de la izquierda, se observa que el límite de resolución para el ojo humano es de 0.1 mm, aproximadamente (es decir: 100 micras que es el tamaño, aproximado, de un ovocito humano). En el esquema se puede apreciar que las células epiteliales, o los hematíes, o las bacterias se encuentran fuera del límite de resolución del ojo humano y en el rango de resolución del microscopio óptico. Dicho límite se establece para el microscopio óptico en 0.1 micras (el tamaño de las mitocondrias que es de 0.1-0.2 micras). El virus de la pleuroneumonía (PPLO: siglas de la terminología inglesa "pleuropneumonia-like organism"; micoplasmas), se encuentra en el límite de resolución del microscopio óptico. Los virus, las proteínas y los aminoácidos se encuentran en el rango de la microscopia electrónica cuyo límite de resolución se mide en Angstroms. En los más modernos microscopios electrónicos la resolución debe estar ahora entre  1 y 2 Angstroms. (10 Aº= 1nm=nanómetro, del griego nano=enano) o una millonésima de mm; 1Aº es, por lo tanto, una diezmillonésima de mm o 0.1 nm).
Un recordatorio del rango de las unidades entre las que nos moveremos:
Micrómetro o micra (um): es una  milésima de mm. 1um = 0.001 mm.
Nanómetro (nm): es una millonésima de mm. 0.000001 o 10 Aº.
Angstroms (Aº): es una diezmillonésima parte de un mm.  
 

   Sin embargo, la correlación morfofuncional puede ser mejor establecida si se aplican determinadas reacciones químicas -en células, tejidos y órganos- que dan lugar a la formación de compuestos  coloreados o (electrodensos, en microscopia electrónica), aptos para ser sometidos a la observación microscópica. Hablamos entonces de

2.-MÉTODOS CITOQUÍMICOS O HISTOQUÍMICOS 
    Según si las reacciones se realizan sobre células o tejidos.
 Algunas metodologías especiales como la Inmunohistoquímica y la Autorradiografía resultan ser ingeniosas combinaciones de Métodos Físicos, Químicos y Biológicos aplicados en el curso de la observación microscópica.

3-LOS MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICOS
    Han representado un avance claro en la investigación de las funciones biológicas. Es posible hoy día, separar algunas estructuras celulares mediante procedimientos de microcirugía (piénsese en las técnicas de fecundación "in vitro"), o por medio de otros métodos físicos como la ultracentrifugación diferencial que permiten separar componentes celulares en los que, posteriormente, se pueden llevar a cabo reacciones químicas o bioquímicas que permitan deducir su composición y la secuencia de los procesos metabólicos que ocurren en las diferentes fracciones obtenidas. A veces, estos procedimientos han permitido separar alguos organitos celulares que luego fueron observados y estudiados con el M.E. (Microscopio Electrónico), tal como ocurrió con los lisosomas. La correlación entre estructura y función se denomina CITOFISIOLOGÍA, cuando se trata de células, o HISTOFISIOLOGÍA cuando dicha correlación es efectuada en los tejidos.


2.-LA OBTENCIÓN DE MUESTRAS BIOLÓGICAS.
  2.1 La elección del método de obtención
     Depende -fundamentalmente- del tipo de material que se quiera estudiar. El problema que se puede plantear es distinto si se trata de bacterias, organismos unicelulares, pluricelulares simples o de un organismo más evolucionado como un ser humano.
    Cuando las funciones vitales deben ser mantenidas, se tienen que tomar pequeñas muestras sin afectar al resto del organismo. En este caso se trata de una BIOPSIA. 
           En otros casos, se trataría de tomar muestras de un cadáver para efectuar un diagnóstico de la causa de la muerte. En esta situación hablamos de AUTOPSIA (ver con mis propios ojos) o NECROPSIA (necros=muerte; opsos=mirar, ojos). 
   
  2.2 El instrumental y las técnicas
       Deben ser adecuados  para cada necesidad. Cuando se trata de muestras unicelulares o pluricelulares, de pequeño tamaño, se tienen que utilizar instrumentos de recolección y disección delicados.
      Los instrumentos de microcirugía y de microdisección que se emplean para disecar parte de una célula o de pequeñas estructuras, son micromanipuladores que permiten, bajo control óptico, la utilización de pequeños instrumentos de cirugía. Las biopsias y las necropsias requieren de la utilización de elementos adecuados para cada necesidad.
       Cuando el fragmento a tomar se encuentra en una superficie, se utilizan las denominadas pinzas de biopsia. La toma de biopsias de algunas superficies internas -como las del aparato digestivo, respiratorio o de algunos órganos de la cavidad abdominal- se denominan biopsias endoscópicas o laparoscópicas. En los órganos situados cerca de la superficie -como sucede con el hígado- se utilizan agujas de biopsia mediante la cual se extrae un pequeño cilindro de material que no daña la función hepática. Cuando las necesidades son más complejas se apela a la cirugía, por ejemplo en las biopsias del intestino.

3.- LAS TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN
      El material biológico puede ser observado:
      1.- In "vivo".
      2.- In "vitro".
      3.-Después de la muerte  (estudio postmortem).
Cualesquiera de estas observaciones presenta ventajas e inconvenientes. 

3.1.-Las técnicas para observación "in vivo"
     En la práctica médica se emplean algunos métodos de observación directa, ayudados por instrumentos ópticos -más o menos complejos- que permiten una evaluación del estado de ciertos órganos. De estos métodos, los más comunes son los utilizados para la observación de superficies como, por ejemplo, el estudio de los vasos de la retina conocido -medicamente- como estudio del fondo de ojo.
          La observación de algunas superficies internas (membranas epiteliales o membranas que "revisten o tapizan" superficies), que se encuentran en el aparato respiratorio, digestivo o urinario, mediante instrumentos que transmiten la imagen por medio de un sistema óptico, y la observación de la superficie interna de los órganos genitales -para el diagnóstico precoz del cáncer- son algunos ejemplos.
   En ocasiones, se estudian en fresco materiales extraídos del organismo, por ejemplo, la visualización de la motilidad de los espermatozoides mediante el microscopio óptico.
  Sin embargo, la observación "in vivo" -mediante el microscopio- ofrece posibilidades limitadas porque:
            a) Los materiales biológicos no suelen ser transparentes.
          b) Cuando sí lo son, carecen del contraste necesario para permitir la diferenciación de las estructuras que lo conforman. El contraste, puede aumentarse mediante la aplicación de diferentes métodos, estos son:
       1.-Métodos físicos
            Los métodos físicos consisten en la utilización de microscopios especiales como el microscopio de contraste de fases o el de Interferencia de Nomarski. El microscopio de campo oscuro cumple finalidades similares y es muy utilizado en el diagnóstico de algunos microorganismos como el Treponema Pallidum, causante de la sífilis.
        2.-Métodos químicos
                   Consisten en la utilización de determinados colorantes químicos que son absorbidos por algunas estructuras celulares del material vivo - y no por otras. Presentan, además, la ventaja de que son poco tóxicos para los seres vivos. Los colorantes empleados para tinciones "in vivo", se denominan colorantes intravitales y se pueden introducir en el organismo por diversas vías de administración: inyección intravascular, vía oral, vaporizando las mucosas o por inmersión en soluciones colorantes. Un muy conocido ejemplo es la coloración intravital del sistema nervioso por el Azul de Metileno. Yo mismo he utilizado la tinta china -administrada intravenosamente a ratas- para marcar a los macrófagos o monocitos de la sangre circulante, capaces de captar las partículas de carbón coloidal de la tinta china. Para la observación vital de bacterias, parásitos o seres unicelulares, se utiliza la técnica de la gota pendiente. Para ello se necesita un portaobjetos excavado y un cubreobjetos. Se coloca una gota del líquido a estudiar en el centro del cubreobjetos, se invierte éste, y se coloca encima del área excavada del portaobjetos; la gota de líquido se queda pendiente o colgando del cubrebjetos ( ¡no de un hilo, como ya pensaban algunos!).

3.2.-Las técnicas para la observación "In Vitro"
    Los métodos "in vitro" son aquellos en los que las muestras se mantienen con vida, pero fuera del organismo.
           Las muestras se pueden mantener vivas tanto tiempo como duren los Medios de Cultivo que proporcionan a las células los nutrientes adecuados.
           El término Cultivo de Tejidos se refiere al estudio de células, tejidos y órganos explantados de animales y mantenidos vivos, o que consiguen crecer "in vitro" (en el cristal o en el frasco), durante más de 24 horas. Por eso distinguiremos:
           1.- Los cultivos celulares
              El término se utiliza para definir a un crecimiento de células, "in vitro", incluyendo al cultivo de una sola célula. En los cultivos celulares, las células no se organizan nunca para formar Tejidos. Pero tengo que decir aquí que si ustedes realizan un cultivo de células de corazón de rata o pollo, por ejemplo, las células cardiacas (es decir, los miocardiocitos), primero forman grupos de escasas células que se van agrupando y, uniéndose poco a poco, se extienden sobre la base del frasco formando lo que se llama una monocapa. Al principio, los grupos pequeños no expresan la función del automatismo cardiaco pero, cuando los miocardiocitos agrupados contactan entre sí y ocupan toda la superficie del frasco de cultivo, en ese momento, se inicia la contracción al unísono de todas las células (se ha producido el llamado acoplamiento eléctrico y metabólico de todas las células del cultivo). "Esto no es un órgano, pero es un primordio de corazoncito"....¡Quizás enamorado del científico que lo observa!
         2.- El cultivo de órganos
         El término indica el mantenimiento o el crecimiento de tejidos, primordios de órganos o al conjunto, o a las partes de de órganos mantenidos "in vitro" de forma que se preserve la arquitectura y/o la función.
             Gracias a los cultivos de tejidos y de órganos se ha aprendido mucho sobre la función celular, el movimiento ameboide de las células, su nutrición, la trnsformación maligna de algunas células, etc.
              Harrison y Alexis Carrel, junto con otros investigadores, fueron los padres de las técnicas utilizadas hoy, para los cultivos de tejidos y de órganos.
              Debido al escaso contraste de las preparaciones "in vitro" se hace aquí más necesario que nunca la utilización de microscopios especiales como son el microscopio de contraste de fases y el de interferencia de Nomarski, así como el uso habitual del microscopio invertido. El contraste se puede aumentar recurriendo a la utilización de técnicas de coloración que se denominan coloraciones supravitales.
             El procedimiento clásico para realizar un cultivo consiste en colocar el fragmento extirpado o las células disociadas de un tejido, en un medio de cultivo. Hoy día se comercializan magníficos medios de cultivo.
              Aunque en investigación básica estos métodos han significado un aporte de valor incalculable para la ciencia, en la práctica los métodos puramente "in vitro" son poco utilizados. Lo usual es que el material biológico sea procesado por medio de métodos combinados "in vitro" y por técnicas postmortem. Por ejemplo, los bacteriólogos cultivan microorganismos pero el diagnóstico de éstos, además de realizarlo a simple vista por el aspecto de las colonias, lo confirman mediante el estudio de preparaciones coloreadas, postmortem. Los genetistas cultivan linfocitos que luego, sometidos a coloraciones postmortem adecuadas, permiten el estudio de los cromosomas.


3.3.-LAS TÉCNICAS POSTVITALES EN EL ESTUDIO DEL MATERIAL BIOLÓGICO.
 Estas son de uso corriente en Histología y Citología, Presentan la desventaja de introducir cambios en el estado original de la muestra pero estas modificaciones pueden evitarse mediante procedimientos de preservación adecuados.
   Las técnicas postvitales se diferencian de las anteriores en que la finalidad es bien distinta. Así como hasta ahora lo que se pretendía era mantener con vida las muestras biológicas, ahora se trata de detener, inmediatamente, todos los procesos vitales. Y esto, por una razón muy sencilla: cuando el destino de una muestra no es el de  estudiar los procesos vitales o el comportamiento de la célula viva sino el de obtener una instantánea de una célula o de un tejido, se hace necesario anticiparse algo  al desarrollo de los acontecimientos que suceden en el interior de la célula, una vez que ésta se halla fuera del organismo. Como consecuencia inmediata de la separación de un medio de cultivo o del organismo, las células o los tejidos sufren, inmediatamente, dos fenómenos carenciales:
      1.- En primer lugar la carencia de oxígeno.
      2.- En segundo, la carencia de nutrientes.
      La consecuencia inmediata de ambos fenómenos es una alteración precoz de las propiedades de las membranas celulares. Estas alteraciones se suceden rápidamente en las paredes de unos organitos celulares denominados LISOSOMAS (cuerpos=somas; lisos/lisis= disolución o destrucción). Ellos, contienen enzimas líticos capaces de digerir todo lo que encuentren a su paso. Este fenómeno se conoce con el nombre de autolisis (de auto=propio y lisis=desaparición). A propósito de ésto, las enfermedades terminan en crisis (bruscamente) o en lisis (poco a poco y progresivamente).
   Este es el mecanismo responsable de la desintegración cadavérica después de la muerte (autólisis cadavérica). 
    La finalidad de las técnicas postmortem es, precisamente, evitar la acción desintegradora de estos enzimas suicidas (líticos). El proceso de detención de los fenómenos autolíticos se conoce con el nombre de FIJACIÓN. La finalidad de la fijación es detener el desarrollo y la progresión de los procesos autoliticos destructivos y conservar las estructuras celulares y tisulares en un estado que sea el más parecido posible al que tenían durante la vida. La fijación (fijar, detener), se realiza gracias a la acción sobre las muestras de determinados productos químicos denominados fijadores. El fijador ideal no existe. El más común es el formaldehido que se utiliza al 4%, a ph 7.2-7.4. El formaldehido se conoce con el nombre de formol comercial y se comercializa en una solución al 40%. Nosotros, en el Laboratorio lo diluimos al 10% y así se consigue una solución al 4%. Sin embargo al diluir el producto comercial al 10% (una parte de formaldehido y 9 de agua), se nombró a esta solución como "solución de formol al 10%", cuya terminología ha sido consagrada por el uso. Así que el llamado formol al 10% es, realmente, una solución de formaldehido comercial al 4%.
Después de haber efectuado la fijación, de los tejidos o de las células, es necesario proporcionar a las muestras una dureza tal que permita seccionarlas en lonchas finas capaces de dejar atravesar la luz cuando se intenten examinar con un microscopio. Esta dureza se consigue recurriendo a dos procedimientos fundamentales:
     1) Sometiendo a los tejidos a una congelación rápida y cortándolos luego en lonchas finas, gracias a máquinas especiales denominadas microtomos de congelación y/o criostatos. Esta técnica se utiliza mucho en el diagnóstico de las llamadas biopsias peroperatorias (biopsias realizadas durante una intervención quirúrgica), en donde la urgencia del diagnóstico es lo fundamental.
   Otras veces, si se trata de estudios de membranas celulares, el tejido congelado no se corta sino que se fractura gracias a la acción de un golpe de cuchilla. Esta técnica permite  que las células congeladas se "fracturen" siguiendo un plano intracitoplasmático o se rompan siguiendo el plano de las membranas celulares, lo que permite el estudio de las "caras" celulares y de las diferenciaciones que aparecen en la superficie de la membrana citoplasmática, tales como los "gaps junctions o uniones de apertura". Estas son una especie de cilindros que permiten la comunicación intercelular y el trasiego de moléculas desde una célula a otra que se encuentre en contacto con ella. En los tejidos epiteliales permiten que el "pool metabólico" intracelular sea conocido por todas las células que componen dicho tejido (pool= reservorio común; caudales metabólicos unidos para un fin; pool de células= agregado de células). Esta técnica se denomina CRIOFRACTURA  (ES DECIR, FRACTURA EN FRÍO QUE SE HACE A -180º). 
    2) Generalmente, la dureza se consigue, cuando no hay prisa, gracias a un procedimiento denominado INCLUSIÓN, mediante el cual las muestras biológicas se someten a una infiltración de sustancias que poseen la propiedad de ser sólidas a la temperatura ambiente y fundirse entre los 40  y los 65-70 grados.
    Cuando los cortes van a ser examinados con un microscopio de luz, la inclusión se realiza en sustancias denominadas PARAFINAS. La infiltración se hace a la temperatura de fusión de las parafinas y luego, el tejido se corta a la temperatura ordinaria en Microtomos diseñados para este fin.
      Si el destino de los cortes fuese el examen con ME (Microscopio Electrónico), entonces la dureza conferida tiene que ser excepcionalmente alta. Para ello, la infiltración del tejido ya no se realiza con parafinas sino con resinas plásticas del tipo del Araldit o  Epon, las cuales en estado sólido o polimerizado son tan duras que necesitan ser cortadas con cuchillas que posean un filo de diamante. Así se consiguen cortes de un  grosor del orden de los 200/300 Aº. Para la obtención de estos cortes se utilizan màquinas denominadas ULTRAMICROTOMOS (ultra=más allá de los microtomos; recuerden "non plus ultra= no más allá", que se localizaba en el estrecho de Gibraltar donde la mitología sitúa a  Hércules, cuyos pies se apoyaban en la tierra situada a ambos lados del estrecho, (para separar ambos continentes) es decir uno en África y otro en España y donde dejó colocadas sus famosas columnas).
    Por lo tanto, las técnicas seguidas para la observación postvital son :
    1) La fijación.
    2) La congelación, o la inclusión en parafina o Araldit.
    3) La obtención de cortes.
        A partir de aquí, las técnicas varían considerablemente, dependiendo de si se trata de preparar las muestras para el estudio con microscopia    óptica o electrónica.
        
LA MICROSCOPIA ÓPTICA (MO):
Preparación de las muestras para el examen con MO. 
     Para su examen, los cortes, realizados con un microtomo de rotación,  se recogeran en cristalitos denominados portaobjetos; después de ser extendidos sobre los portas se tienen que someter a la acción de las sustancias colorantes. Este procedimiento se denomina Técnica de Tinción o coloración Histológica.
     El principio técnico de las coloraciones o tinciones histológicas se basa en
 la afinidad particular o específica de ciertos tejidos o componentes celulares por una sustancia colorante determinada. Toda la Histología  clásica y la Histopatología descansan sobre este principio -verificado muchas veces pero todavía mal comprendido. Por lo tanto, podemos decir que los colorantes sirven para:
1) Aumentar el contraste de las estructuras orgánicas.
2) Para identificar componentes por su distinta afinidad tintorial.
     Los colorantes pueden actuar de dos maneras distintas para aumentar el contraste:
       a) Cuando un componente absorbe gran cantidad de colorante su densidad óptica aumenta, reduciéndose la amplitud de la onda luminosa que lo atraviesa y apareciendo, debido a eso, más oscuro que los otros que absorben poco colorante, que se ven más claros.
          b) El colorante absorbido imparte su color a la luz que emerge del componente que absorbió dicho colorante; con lo cual, las imágenes que observaremos con el microscopio óptico son, siempre, imágenes coloreadas a diferencia de lo que sucede con el ME (microscopio Electrónico), porque en éste el aumento del contraste se realiza por incremento de la densidad electrónica mediante la aplicación de sales de metales pesados que se depositan sobre las estructuras. Por  lo tanto, las imágenes que se ven con el ME no poseen color ya que el ME no actúa por absorción de ondas lumínicas sino por dispersión de electrones  (aquí, sucede lo contrario de lo que ocurrió en el cine: se pasó -con el avance de la tecnología- de las imágenes en blanco y negro al color; en microscopia se pasó del color al blanco y negro, eso sí, con un avance muy importante en el gran incremento de la resolución). 
    Al principio, los cortes se teñían con un solo colorante. Más tarde se utilizaron dos, de manera consecutiva: primero se usaba uno que teñiría determinadas estructuras; seguidamente, el otro que teñiría las estructuras restantes, de un color diferente. La coloración de rutina más utilizada en el Laboratorio es la bicrómica (bi=dos; chromo=color) denominada de Hematoxilina-eosina. La Hematoxilina posee color azul. La eosina, color rosado o anaranjado.

LOS TÉRMINOS BASOFILIA Y ACIDOFILIA/EOSINOFILIA: SU 
SIGNIFICADO.
     En los cortes histológicos teñidos con Hematoxilina (color azul) y eosina (color naranja), algunas partes de las células y de los tejidos se tiñen de color azul mientras que otras lo hacen de color  rosado o  anaranjado. Las teñidas de color azul por la hematoxilina se dice que son basófilas (poseen apetencia por los colorantes básicos), mientras que las teñidas de color rosado por la eosina se dice que son acidófilas (o que poseen apetencia por los colorantes ácidos). En las células que se tiñen con la hematoxilina-eosina (llamada coloración bicrómica o combinada), el núcleo celular o algunos de sus componentes citoplasmáticos se tiñen de color azul, es decir, son basófilos. Eso indica que las partes del núcleo o del citoplasma que se tiñen de color azul contienen una gran cantidad de ácidos nucleicos (ADN y ARN). 
¿Qué es lo que se tiñe de color rosado con la eosina en una célula o un tejido? Pues, la mayor parte del citoplasma es acidófilo o eosinófilo (es apetente por la eosina o por los colorantes ácidos). En algunos tipos de células, los gránulos que se encuentran en el citoplasma se tiñen intensamente de color rosa por la eosina (el ejemplo paradigmático son los leucocitos eosinófilos de la sangre; de ahí su nombre). Se dice, pues, que el citoplasma celular es -fundamentalmente- acidófilo o eosinófilo; así como todos los granos de secreción y todas aquellas estructuras que se tiñan de rosa con la eosina (lo contrario vale, también, para los gránulos azules de los leucocitos basófilos).
¿ Porqué basófilo y acidófilo, en lugar de  hematoxilinófilo y eosinófilo?
   La razón es que ésta ha sido la terminología consagrada por el uso y, también, por el hecho de que los colorantes son sales neutras que poseen un radical ácido y otro básico. En los colorantes básicos, el color reside en el radical básico (la mayoría de los colorantes nucleares). En los colorantes ácidos reside en el radical ácido.
En resumen, aún a costa de resultar pesado:
    Basófilo es todo lo que se tiñe de color azul con la hematoxilina  (el núcleo, los cuerpos de Mallory en los hepatocitos en los alcohólicos, los gránulos del citoplasma de los leucocitos basófilos de la sangre y de los mastocitos o células cebadas del tejido conectivo, etc.
   Eosinófilo es todo aquello que se tiñe de color anaranjado con la eosina (el citoplasma, los gránulos de secreción de los leucocitos eosinófilos, los cuerpos apoptósicos, etc.


EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET):

La preparación de las muestras para el examen con MET.
   El procedimiento a seguir para la preparación de las muestras es genéricamente, similar al descrito para el microscopio óptico, es decir:
1.-La fijación (en Glutaraldehido, seguido de una postfijación en tetraóxido de Osmio).
2.-Deshidratación (en alcoholes en concentraciones crecientes).
2.-La inclusión (en resinas plásticas del tipo Araldit, Epon o Spurr).
3.-La obtención de cortes (en ultramicrotomos con cuchillas de diamante).

ESTE PROCEDIMIENTO SE DENOMINA TÉCNICA HISTOLÓGICA CLÁSICA.
Ahora veremos algunas particularidades que ocurren en la preparación de muestras.
1.-En el Montaje
    Los cortes no se recogen sobre portaobjetos sino sobre rejillas de cobre que poseen un diámetro de 5mm.
2.-El Contrastado
    En lugar de colorantes, para el aumento del contraste se utiliza una solución de metales pesados (plo plásticosmo).
       Las imágenes obtenidas son, por lo tanto, en blanco y negro.

EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (MEB):
La preparación de las muestras para el examen con MEB.
          La preparación de las muestras, aquí sigue las mismas pautas descritas más arriba denominadas Técnica Histológica Clásica, con algunas particularidades, es decir: 
1.-Fijación
2.-Deshidratación
3.-No inclusión en materiales plásticos
4,-Secado de las muestras
    Se realiza en una cámara especial, de secado. El secado se lleva a cabo mediante la evaporación del líquido donde se encuentran sumergidas las muestras, de una forma brusca. La evaporación ocurre cuando la temperatura y la presión suben hasta un punto denominado crítico. Antes se utilizaba el gas Freón 11 o 13; ahora se hace con gas carbónico, debido al daño ocasionado por el Freón a la capa de ozono.
   A diferencia de lo que sucede con el MET y con el MO, en los que los rayos -de luz o electrónicos- atraviesan la muestra, en el MEB el rayo de electrones realiza un barrido de la superficie de la muestra, la cual ha sido recubierta -previamente- con una finísima capa de oro. Así, el rayo electrónico realiza un barrido de la superficie sin atravesar la muestra; por esa razón no es necesario cortar en microtomos. Los rayos reflejados procedentes de la superficie barrida son recogidos en un colector que los dirige a una pantalla de televisión. Las fotografías se obtienen de esa pantalla. Las imágenes ofrecen un aspecto tridimensional y en blanco y negro, aunque ya empiezan a comercializarse microscopios que aportan fotografías en color.

OTRAS TÉCNICAS
  Aunque serán descritas en su momento comentaré algunas de especial relevancia en Histología.

1.-LA HISTOQUÍMICA
     Aunque el mecanismo íntimo de las coloraciones no siempre son bien conocidos, es posible utilizar reacciones químicas conocidas para investigar la naturaleza química de los componentes celulares y/o tisulares. Estas reacciones se verifican en los cortes de tejido y los productos de la reacción se pueden hacer visibles al microscopio, indicando la existencia, en determinados lugares, de grupos químicos específicos. La parte de la Histología que trata de estos problemas se denomina Histoquimia o Histoquímica y la reacción química en la que se basa una tinción se denomina reacción Histoquímica ( por ejemplo, la demostración de hierro  y cobre en los tejidos afectados por una supuesta electrocución).

2.- LOS MÉTODOS DE FRACCIONAMIENTO CELULAR
     Consisten en la separación de fracciones de la célula, seguida del análisis bioquímico cuantitativo de sus componentes. Los principales métodos de fraccionamiento, mediante centrífugas, son:
   2.1 La Ultracentrifugación diferencial y
   2.2 La Ultracentrifugación contra gradiente de densidad.
3.-LOS METODOS INMUNOHISTOQUÍMICOS Y
4.-LA AUTORRADIOGRAFÍA (que sirve para detectar isóotopos radiactivos en los tejidos).

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